Методики эксперимента

Нитроцеллюлозные фильтры для радиоавтографии диаметром 2.5 см вырезали из нитроцеллюлозных фильтров MF-MilliporeTM диаметром 9 см. Фильтры для нанесения проб выдерживали в буфере для связывания в течение 12-14 ч при 4°С. Фильтры, использующиеся для контроля, оставляли сухими. Перед нанесением пробы фильтры промывали 3 мл буфера для связывания. Пробы (95 мкл) наносили на фильтр, промывали 5 мл буфера для связывания и высушивали при комнатной температуре в течение 10 мин. Контроль (95 мкл) наносили на сухой фильтр и высушивали при комнатной температуре в течение 10 мин. Высушенные фильтры сканировали при помощи фосфоримиджера Molecular Imager FX (BioRad, США). Для получения количественных характеристик радиоавтографы нитроцеллюлозных фильтров переводили в цифровую форму в программном пакете Quantity one (BioRad, США). Долю комплексов олигонуклеотидов с белками определяли как отношение интенсивности пятна комплексов к интенсивности пятна свободных олигонуклеотидов. Полученные данные описывали приведенным ниже уравнением, используя программу SigmaPlot 8.0:

f = С·(Kd + [140] + [P] - ((Kd + [140] + [P])2 - 4·[140]·[P])0.5)/(2·[140]),

где [P] - концентрация белка; [140] - концентрация 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки; f - доля связавшихся олигонуклеотидов; Kd - константа диссоциации комплексов 2'-F-РНК с антителами; С - константа эффективности связывания комплексов аутоантител и олигонуклеотидов с нитроцеллюлозными фильтрами.

Используя полученные данные, находили константу С. Отношение f/С давало fнорм - нормированное значение доли комплексов олигонуклеотидов с аутоантителами. Нормированные данные описывали тем же уравнением, принимая С равной 1, и находили Kd.

Определение Kd комплексов аутоантител с 2'-F-модифицированными РНК-библиотеками

Определение Kd проводили аналогичным образом. Пробы аутоантител готовили с учетом полученных значений доли комплексов аутоантител и 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки в зависимости от концентрации аутоантител. Концентрации антител для определения Kd комплексов аутоантител с исходной 2'-F-модифицированной РНК-библиотекой были равны: 12000 нМ, 6000 нМ, 3000 нМ, 1000 нМ, 330 нМ, 110 нМ, 37 нМ, 4.1 нМ. Концентрации антител для определения Kd комплексов аутоантител с 2'-F-модифицированной РНК-библиотекой после 6-го раунда отбора были равны: 1800 нМ, 600 нМ, 200 нМ, 66 нМ, 22 нМ, 7.4 нМ, 2.4 нМ, 0.8 нМ, 0.3 нМ. Концентрации антител для определения Kd комплексов аутоантител с 2'-F-модифицированной РНК-библиотекой после 10-го раунда отбора были равны: 600 нМ, 200 нМ, 66 нМ, 22 нМ, 7.4 нМ, 2.4 нМ, 0.8 нМ, 0.3 нМ. [32P]-Меченую 2'-F-пиримидинсодержащую РНК-библиотеку растворяли в буфере для связывания из расчета (n+1) пмоль РНК, где n - количество проб аутоантител. Комплексообразование, мобилизацию на нитроцеллюлозных фильтрах и расчет Kd проводили как указано выше.

Хроматографическое разделение 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки после 10-го раунда SELEX по сродству к поликлональным аутоантителам

Хроматографию проводили на хроматографе BioCAD Sprint (Perseptive Biosystems, США), измерение оптической плотности вели при 260 нм. Колонку (9x30 мм) с иммобилизованным на BrCN-активированной сефарозе пулом поликлональных аутоантител предварительно промывали 20 мМ Tрис-HCl (pH 7.5) со скоростью потока элюента, равной 0,2 мл/мин. На колонку наносили 3.55 о.е. 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки после 10-го раунда SELEX (60 мкл) и промывали 20 мМ Tрис-HCl (pH 7.5) (фр. 1) для удаления несвязавшихся молекул 2'-F-РНК. Окончание стадии промывки контролировали по изменению оптической плотности. Далее проводили ступенчатую элюцию 2'-F-РНК растворами следующего состава, контролируя оптическую плотность фракций: 0.1 М NaCl в 20 мМ Tрис-HCl, pH 7.5 (фр. 2); 0.3 М NaCl в 20 мМ Tрис-HCl, pH 7.5 (фр. 3); 0.5 М NaCl в 20 мМ Tрис-HCl, pH 7.5 (фр. 4); 1 М NaCl в 20 мМ Tрис-HCl, pH 7.5 (фр. 5); 2 М NaCl в 20 мМ Tрис-HCl, pH 7.5 (фр. 6); 3 М NaCl в 20 мМ Tрис-HCl, pH 7.5 (фр. 7); 1 М MgCl2 в 20 мМ Tрис-HCl, pH 7.5 (фр. 8); 2 М MgCl2 в 20 мМ Tрис-HCl, pH 7.5 (фр. 9); 3 М MgCl2 в 20 мМ Tрис-HCl, pH 7.5 (фр. 10) и 0.1 М глицином, pH 2.6 (фр. 11) (рис. 18). К фракции 11 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки в 0.1 М глицине добавляли 1 М Tрис-HCl (pH 8.0) до pH ~7.5. Полученные фракции 2'-F-РНК обессоливали и концентрировали на колонках Microcon YM-30 (Millipore, Ирландия), проводя следующие операции: