Методики эксперимента

Получение 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки

Синтез дцДНК-библиотеки с использованием оцДНК-матрицы [54]

5'-Праймер dm 28 или dm 28 long (2 нмоль) и оцДНК-библиотеку (п. 2.3.3.) (1 нмоль) предварительно инкубировали в буфере (90 мкл), содержащем 10 мM Tрис-HCl (pH 8.0) и 10 мM MgCl2, в течение 5 мин при 90°С (микротермостат “Модель 206”, ООО “БИС-Н”, Россия). Реакционную смесь охлаждали во льду в течение 5 мин и добавляли в буфер (600 мкл), содержащий 10 мM Tрис-HCl (pH 7.5), 5 мM MgCl2, 7.5 мM DTT, 0.5 мM dGTP, 0.5 мM dATP, 0.5 мM dCTP, 0.5 мM dTTP, 50 е.а./мл фрагмента Кленова ДНК-полимеразы E.coli. Реакционную смесь инкубировали при 37°С в течение 1 ч (суховоздушный термостат, Jouan, Франция). Для остановки реакции добавляли 12 мкл 100 мМ Na2EDTA (pH 8.3). Олигонуклеотидный материал осаждали добавлением 2,5-кратного избытка этанола в присутствии 0.3 М CH3CO2Na (pH 7.8) с последующим выдерживанием при -20°С в течение 10-12 ч. Осадок отделяли центрифугированием (центрифуга MiniSpin, 14500 об./мин, 10 мин, 20°С), супернантант отбирали, осадок промывали 75%-ным этанолом и сушили при 2-4 мм. рт. ст. в течение 20 мин. Полученный осадок растворяли в 18 мкл бидистиллированной воды. К раствору добавляли 2 мкл буфера В и наносили на 12%-ный нативный ПААГ толщиной 0.8 мм. Олигонуклеотиды визуализировали в УФ-свете (п. 2.2). Участок геля, содержащий дцДНК-библиотеку, вырезали, заливали 1 мл 2 мМ Na2EDTA в 0.3 М CH3CO2Na (pH 7.8) и перемешивали при комнатной температуре в течение нескольких часов (термостатируемый шейкер Thermomixer compact, 400 об./мин). Элюат отбирали, гель промывали 1 мл того же раствора. Олигонуклеотидный материал осаждали добавлением 2,5-кратного избытка этанола как описано выше. Осадок дцДНК-библиотеки растворяли в 20 мкл буфера (10 мМ Tрис-HCl (pH 8.0) и 1 мМ Na2EDTA). Полученный раствор дцДНК-библиотеки использовали в качестве матрицы в реакции транскрипции in vitro.

Транскрипция in vitro с использованием набора “TranscriptAid T7 high yield transcription kit” (Fermentas)

Реакцию синтеза 2'-F-РНК проводили в однократном буфере TranscriptAid™ (Fermentas) (20 мкл), содержащем 2 мкл TranscriptAid™ смеси ферментов (Fermentas), 2 мкг дцДНК-библиотеки, по 2 мкл 100мМ ATP, GTP, CTP, UTP (Fermentas) при 37°С в течение 7 ч (суховоздушный термостат). По окончании инкубации в реакционную смесь добавляли 10 мкл ДНКазы I, свободной от РНКаз, и инкубировали в течение 15 мин при 37°С (суховоздушный термостат). Затем в реакционную смесь добавляли 100 мМ Na2EDTA (pH 8.0) до концентрации 40 мкM в реакционной смеси и инкубировали при 65°С в течение 10 мин (микротермостат “Модель 206”). К реакционной смеси добавили 50 мкл 3 М CH3CO2Na (pH 5.2) и последовательно экстрагировали смесью фенол:хлороформ (1:1) (500 мкл) и хлороформом (500 мкл). РНК-транскрипт осаждали добавлением 2.5-кратного избытка этанола с последующим выдерживанием при -20°С в течение 10-12 ч. Осадок 2'-F-РНК отделяли центрифугированием (центрифуга Centrifuge 5415 R, Eppendorf, Германия, 13000 об./мин, 10 мин, 4°С), промывали 75%-ным этанолом и сушили при 2-4 мм. рт. ст. в течение 20 мин. Полученный осадок РНК-транскрипта растворяли в буфере А и проводили гель-электрофорез в 12%-ном ПААГ в денатурирующих условиях. Олигонуклеотиды визуализировали в УФ-свете (п. 2.2). Участок геля, содержащий 2'-F-модифицированную РНК-библиотеку, вырезали, заливали 1 мл 0.3 М CH3CO2Na (pH 5.2), перемешивали при комнатной температуре в течение нескольких часов (термостатируемый шейкер Thermomixer compact, 400 об./мин), элюат отбирали, гель промывали 1 мл того же раствора. Олигонуклеотидный материал осаждали этанолом как описано выше. Полученную 2'-F-модифицированную РНК-библиотеку растворяли в бидистиллированной воде и хранили при -20°С.