Методики эксперимента

Амплификацию проводили в следующих условиях: 93°С 3 мин, 93°С 30 сек, 63°С 1 мин, 72°С 1 мин, затем повтор еще 20 циклов, охлаждение до 4°С. Продукты амплификации анализировали гель-электрофорезом в 12%-ном ПААГ в денатурирующих условиях.

Очистка ПЦР-продукта

Способ 1. ПЦР-продукт выделяли препаративным гель-электрофорезом в 12%-ном ПААГ в нативных условиях, используя гель толщиной 0.4 мм. Олигонуклеотиды визуализировали в УФ-свете (п. 2.2). Участок геля, содержащий дцДНК-библиотеку, вырезали, заливали 1 мл 2 мМ Na2EDTA в 0.3 М CH3CO2Na (pH 7.8), перемешивали при комнатной температуре в течение нескольких часов (термостатируемый шейкер Thermomixer compact, 400 об./мин), элюат отбирали, гель промывали 1 мл того же раствора. Олигонуклеотидный материал осаждали добавлением 2,5-кратного избытка этанола с последующим выдерживанием при -20°С в течение 10-12 ч. Осадок ПЦР-продукта отделяли центрифугированием (центрифуга MiniSpin, 14500 об./мин, 10 мин, 20°С), супернантант отбирали, осадок промывали 75%-ным этанолом и сушили при 2-4 мм. рт. ст. в течение 20 мин. Полученную дцДНК растворяли в буфере (10 мМ Tрис-HCl (pH 8.0), 1 мМ Na2EDTA) и хранили при -20°С.

Способ 2. ПЦР-продукт очищали от праймеров, дезоксирибонуклеозидтрифосфатов и фермента с использованием набора “DNA clean & concentrator-25” (Zymo Research, США):

1. колонку Zymo-Spin помещали в пробирку на 2 мл;

2. к реакционной смеси (1000 мкл) после проведения ПЦР добавляли 2-кратный избыток (по объему) ДНК-связывающего буфера (Zymo Research), перемешивали, центрифугировали в течение 15 сек при 14400 об./мин, 20°С (центрифуга MiniSpin);

. 800 мкл полученного раствора наносили на колонку и центрифугировали в течение 30 сек при 14400 об./мин, 20°С;

. колонку промывали 2х200 мкл промывочного буфера (Zymo Research), центрифугировали в течение 30 сек при 14400 об./мин, 20°С;

. колонку переносили в новую пробирку на 1.5 мл;

. элюировали олигонуклеотидный материал с колонки добавлением 30 мкл буфера (10 мМ Tрис-HCl (pH 8.0), 1 мМ Na2EDTA), центрифугировали в течение 30 сек при 14400 об./мин, 20°С.

In vitro транскрипция

Полученную дцДНК-библиотеку далее использовали в реакции транскрипции in vitro как описано в п. 2.3.4. 2'-F-Модифицированную РНК-библиотеку очищали препаративным гель-электрофорезом в 12%-ном ПААГ толщиной 0.4 мм в денатурирующих условиях. Олигонуклеотиды визуализировали в УФ-свете (п. 2.2). Участок геля, содержащий 2'-F-модифицированную РНК-библиотеку, вырезали, заливали 1 мл 0.3 М CH3CO2Na (pH 5.2), перемешивали при комнатной температуре в течение нескольких часов (термостатируемый шейкер Thermomixer compact, 400 об./мин), элюат отбирали, гель промывали 1 мл того же раствора. Олигонуклеотидный материал осаждали этанолом как описано выше. 2'-F-РНК растворяли в бидистиллированной воде и хранили при - 20°С.

SELEX, один раунд (по оптимизированному нами протоколу [50])

Иммобилизация аутоантител, образование комплексов аутоантител с 2'-F-модифицированной РНК-библиотекой

Поликлональные аутоантитела класса G (2.6 мг/мл, 0.7 мкл) в 50 мМ Tрис-HCl (pH 7.5), разбавляли 0.05 М NaHCO3/Na2CO3 (pH 9.6) до концентрации 10 мкг/мл. 100 мкл полученного раствора помещали в ПЦР-пробирку и инкубировали при 4°С в течение 16-20 ч. Раствор несвязавшихся со стенками пробирки антител удаляли. Иммобилизованные на стенках ПЦР-пробирки антитела промывали 4х100 мкл промывочного буфера (50 мМ Tрис-HCl (pH 7.5), 200 мМ KCl, 0.05%-ный (по объему) Твин 20). Далее в ПЦР-пробирку с иммобилизованными антителами добавляли 500 мкл блокирующего буфера (50 мМ Tрис-HCl (pH 7.5), 200 мМ KCl, 0.1%-ный (масса к объему раствора) казеин) и инкубировали при комнатной температуре 1 ч, после чего еще раз промывали антитела 500 мкл промывочного буфера.