Методики эксперимента

Трансформация компетентных клеток плазмидной ДНК

Трансформацию компетентных клеток проводили согласно протоколу “Fast Transformation of Z-competentTM Cells” (Zymo Research). Перед трансформацией компетентные клетки размораживали при 0°С. К 200 мкл суспензии компетентных клеток E.coli добавляли лигазную смесь (см. выше) (5 мкл) и аккуратно перемешивали. Полученную суспензию клеток (50 мкл) высевали на предварительно нагретую до 37°С чашку Петри с селективной средой LB, покрытой 10%-ным X-Gal в DMFабс. (40 мкл) и содержащей 1.5% агара, 100 мкг/мл ампициллина и 0.8 мМ IPTG, и инкубировали при 37°С в течение 16-18 ч. Индивидуальные колонии трансформированных клеток E.coli переносили на чашки Петри с селективной средой LB (по 4 колонии на чашку) и инкубировали при 37°С в течение 16-18 ч.

Определение наличия дцДНК-библиотеки в плазмидной ДНК трансформированных клеток [162]

Наличие дцДНК-библиотеки в плазмидной ДНК трансформированных клеток E.coli проверяли с помощью ПЦР. Для этого часть каждой трансформированной колонии E.coli переносили в 5 мкл воды и суспензировали. Для каждой колонии проводили ПЦР в буфере (100 мкл), содержащем 7.5 мМ MgCl2, 1 мM dGTP, 1 мM dATP, 1 мM dCTP, 1 мM dTTP, 2 мкМ 5'-праймера seq 1, 2 мкМ 3'-праймера seq 2, 25 е.а./мл Taq ДНК-полимеразы, 10 мМ Tрис-HCl (pH 8.3), 50 мМ KCl, 5 мкл клеточной суспензии. ПЦР-пробирки с реакционными смесями помещали в амплификатор Mastercycler gradient.

Амплификацию проводили в следующих условиях: 94°С 1 мин, 94°С 15 сек, 55°С 1 мин, 72°С 2 мин, затем повтор еще 30 циклов, 72°С 2 мин, охлаждение до 4°С.

Полученные реакционные смеси анализировали гель-электрофорезом в 12%-ном денатурирующем ПААГ с последующим окрашиванием геля раствором красителя “Stains-All”.

Выделение плазмидной ДНК

Выделение плазмидной ДНК осуществляли с использованием набора QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN, США). Селективную среду LB (3 мл), содержащую 100 мкг/мл ампициллина, инокулировали трансформированными клетками E.coli и инкубировали 12-16 ч при 37°С и 250 об./мин в термостатируемом шейкере Environmental Shaker - Incubator ES-20 (BIOSAN, Латвия). Клетки осаждали центрифугированием (центрифуга MiniSpin, 3 мин, 8500 об./мин, 20°С). Супернатант удаляли, клетки суспензировали в 250 мкл буфера P1 (QIAGEN). К полученной суспензии добавляли 250 мкл буфера P2 (QIAGEN), пробирку переворачивали несколько раз, пока суспензия не приобрела однородный синий цвет. К полученной суспензии добавляли 350 мкл буфера N3 (QIAGEN), пробирку переворачивали несколько раз до образования однородной белой взвеси в прозрачном растворе. Взвесь осаждали центрифугированием (центрифуга MiniSpin, 10 мин, 13000 об./мин, 20°С) и отбирали супернантант, содержащий плазмидную ДНК. Плазмидную ДНК очищали на колонках QIAprep Spin Column (QIAGEN):

) колонку помещали в пробирку на 2 мл, наносили супернантант и центрифугировали в течение 45 сек при 13000 об./мин, 20°С (центрифуга MiniSpin);

) промывали колонку 750 мкл буфера PE (QIAGEN), центрифугировали в течение 45 сек при 13000 об./мин, 20°С (центрифуга MiniSpin);

) очистив пробирку-премник, дополнительно центрифугировали колонку в течение 1 мин при 13000 об./мин, 20°С (центрифуга MiniSpin);