Методики эксперимента

) переносили колонку в новую пробирку на 1.5 мл, наносили на колонку 50 мкл 10 мМ Tрис-HCl (pH 8.5), выдерживали при комнатной температуре в течение 1 мин, центрифугировали 1 мин при 13000 об./мин, 20°С (центрифуга MiniSpin).

Определение наличия дцДНК-библиотеки в полученных плазмидных ДНК

Наличие дцДНК-библиотеки в полученных плазмидных ДНК определяли с помощью ПЦР, как описано в п. 2.3.14. В качестве матрицы использовали 0.2 пкмоль выделенной плазмидной ДНК. Полученные реакционные смеси анализировали гель-электрофорезом в 12%-ном денатурирующем ПААГ с последующим окрашиванием геля раствором красителя “Stains-All”.

Определение нуклеотидной последовательности плазмидных ДНК

Определение нуклеотидной последовательности полученных плазмид проводили по методу Сенгера с использованием набора Big Dye Terminators v.3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США). Реакционная смесь (25 мкл) содержала однократный буфер для секвенирования (Applied Biosystems), 1.5 мкл флуоресцентно меченых дидезоксинуклеозидтрифосфатов Big Dye (Applied Biosystems), 250 фмоль плазмидной ДНК и 5 мкмоль праймера M13 reverse. ПЦР-пробирки с реакционными смесями помещали в амплификатор Mastercycler gradient.

Амплификацию проводили в следующих условиях: 97°С 1 мин, 97°С 10 сек, 50°С 5 сек, 60°С 4 мин, затем повтор еще 30 циклов, 94°С 3 мин, охлаждение до 4°С.

Полученные реакционные смеси очищали различными способами:

Вариант 1. (с использованием набора IllustraTM AutoSeq G-50 Dye Terminator Removal Kit (GE Healthcare, Великобритания)):

) сорбент колонки суспензировали перемешиванием на вортексе REAX control (Heidolph, Германия);

) крышку колонки открывали на четверть оборота, отламывали наконечник колонки, помещали ее в пробирку на 1.5 мл и центрифугировали в течение 1 мин при 4600 об./мин, 20°С (центрифуга Centrifuge 5415 R (Eppendorf));

) переносили колонку в новую пробирку 1.5 мл;

) на колонку наносили реакционную смесь (25 мкл) и центрифугировали в течение 1 мин при 4600 об./мин, 20°С (центрифуга Centrifuge 5415 R (Eppendorf)).

Полученную пробу упаривали досуха на вакуумном испарителе Concentrator 5301 (Eppendorf) в течение 20 мин при 45°С и отдавали в ЦКП “Секвенирование ДНК” СО РАН.

Вариант 2. (осаждение с использованием изопропанола):

) к реакционным смесям добавляли равный объем бидистиллированной воды, перемешивали и переносили в пробирки на 1.5 мл;

) в каждую пробирку добавляли 75 мкл 100%-ного изопропанола (осч), перемешивали и оставляли при комнатной температуре на 25 мин;

) центрифугировали пробы в течение 25 мин при 13200 об/мин, 18°С (центрифуга Centrifuge 5415 R (Eppendorf));

) отбирали супернантант, промывали осадок 250 мкл 75%-ного этанола, центрифугировали пробы в течение 10 мин при 13200 об/мин, 18°С (центрифуга Centrifuge 5415 R (Eppendorf));

) повторяли промывку 75%-ным этанолом, сушили пробы в течение 20 мин при 2-4 мм. рт. ст.

Полученные пробы были анализированы на секвенаторе ABI Prism 3130xl (Applied Biosystems, Великобритания). Данные были обработаны в программном пакете Sequence Scanner (Applied Biosystems).

Поиск гомологичных участков РНК-клонов фракций I, II и III [90]