Методики эксперимента

Вектор pUC18 также подвергали эндонуклеазному расщеплению. Реакцию гидролиза проводили в однократном буфере FastDigest (Fermentas) (20 мкл), содержащем 1.5 пкмоль pUC18, 50 е.а./мл рестриктазы BamHI и 50 е.а./мл рестриктазы HindIII при 37°С в течение 10 мин, а затем при 80°С в течение 10 мин (термостатируемый шейкер, BIOER). К реакционной смеси добавляли 150 ед. акт. бактериальной щелочной фосфатазы и инкубировали при 60°С в течение 1 ч. Полученный линеаризованный вектор очищали электрофорезом в 1%-ном агарозном геле (п. 2.2.). Участок геля, содержащий линеаризованный вектор, вырезали, измельчали скальпелем и проводили выделение вектора из геля на колонках GenEluteTM Minus EtBr Spin Columns (Sigma-Aldrich, США):

1) колонку GenEluteTM Minus EtBr Spin Column помещали в пробирку на 1.5 мл;

2) на колонку наносили 100 мкл бидистиллированной воды и центрифугировали 5 сек при 3500 об./мин, 20°С (центрифуга MiniSpin);

) помещали колонку в новую пробирку на 1.5 мл;

) переносили гель с вектором на колонку, центрифугировали 10 мин при 14500 об./мин, 20°С.

Полученный при этом линеаризованный вектор осаждали добавлением 2.5-кратного избытка (по объему) этанола как описано в пункте 2.3.4. Осадок растворяли в бидистиллированной воде и хранили при - 20°С.

Получение плазмидной ДНК

Реакцию лигирования проводили в однократном буфере Tango (Fermentas) (20 мкл), содержащем 4 пкмоль дцДНК-библиотеки с “липкими” концами, 0.2 пкмоль вектора pUC18, 0.5 мМ DTT, 1мМ ATP, 33 мМ Tрис-ацетат (pH 7.9), 10 мМ (CH3CO2)2Mg, 66 мМ CH3CO2K, 0.1 мг/мл BSA, 50 е.а./мл T4 ДНК-лигазы при 14°С в течение 14-16 ч (термостатируемый шейкер, BIOER). Затем реакционную смесь в течение 5 мин инкубировали при 65°С и охлаждали до комнатной температуры. К реакционной смеси добавляли 20 ед. акт. эндонуклеазы рестрикции PstI и инкубировали при 37°С в течение 30 мин. Полученную реакционную смесь хранили при -20°С.

Приготовление компетентных клеток

Компетентные клетки E.coli штамма DH5α готовили с использованием набора “ Z-Competent E.coli Transformation Kit ” (Zymo Research, США). Среду LB готовили из расчета 10 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 10 г NaCl на 1 л воды и стерилизовали автоклавированием. В полученную среду LB (2 мл) вносили суспензию клеток E.coli и инкубировали 12-16 ч при 37°С и 250 об./мин в термостатируемом шейкере Environmental Shaker - Incubator ES-20 (BIOSAN, Латвия). Полученную суспензию клеток (0.5 мл) вносили в 50 мл среды ZymoBrothTM (Zymo Research) и инкубировали при 250 об./мин и 30°С на термостатируемом шейкере до достижения клеточной суспензией оптической плотности D550 = 0.4-0.6 о.е./мл (Spectronic Genesys 5 Spectrophotometer, Milton Roy, США).

Полученную культуру переносили в пробирку для центрифугирования, охлаждали во льду 20 мин и осаждали центрифугированием (центрифуга Centricon T-42K (Kontron Instruments, США) ротор A-16C, 3000 об./мин, 10 мин, 2°С). Супернатант сливали, края пробирки вытирали насухо. Клетки суспензировали в 5 мл предварительно охлажденного до 0°С однократного промывочного буфера (Zymo Research), инкубировали во льду 20 мин и осаждали центрифугированием (центрифуга Centricon T-42K, Kontron Instruments, США, ротор A-16C, 3000 об./мин, 10 мин, 2°С). Супернатант сливали, края пробирки вытирали насухо. Клетки ресуспензировали в 5 мл предварительно охлажденного до 0°С однократного буфера Competent (Zymo Research). Клеточную суспензию расфасовывали по 200 мкл в стерильные предварительно охлажденные до 0°С пробирки на 1.5 мл и хранили при -70°С.