Материалы и методы исследования
Готовили мазок по методу Циля-Нильсена для выявления кислотоустойчивых микобактерий.
Производили субкультивирование на плотной яичной среде для подтверждения роста типичных колоний микобактерий.
Производили субкультивирование на среде Левенштейна-Йенсена, содержащей 1000 мкг/мл салицилата натрия или 500 мкг/мл паранитробензойной кислоты, для дифференциации МБТ и нетуберкулезных микобактерий.
При необходимости, для того чтобы убедиться в отсутствии контаминации позитивной емкости посторонней микробной флорой, готовили мазки с окраской по Граму и производили пересев содержимого пробирки на чашку с кровянымагаром. Наличие роста на чашке в результате инкубации в течение 24 часов при 37°С свидетельствует о микробной контаминации материала.
Чувствительность выделенных штаммов к ряду ПТП (изониазид, рифампицин, этамбутол (E), стрептомицин (S) и другие) определяли путем высева чистых культур на плотную питательную среду Левенштейна-Йенсена, методом абсолютных концентраций, регламентированного инструкцией по применению «Организация определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза» от 30.12.2002 г. (регистрационный номер 107-1102), разработанной в ГУ «НИИ пульмонологии и фтизиатрии».
Определение лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза кпротивотуберкулезным препаратам первого ряда
В нашей стране получило распространение определение лекарственной устойчивости методом абсолютных концентраций на среде
Левенштейна-Йенсена.
Метод абсолютных концентраций
Метод позволяет исследовать любое количество микобактерий в диагностическом материале, поскольку для определения лекарственной устойчивости используются штаммы микобактерий, предварительно выделенные на питательных средах. Так как сроки выделения возбудителя на питательных средах составляют не менее 1 - 1,5 месяцев, результаты определения лекарственной устойчивости указанным методом обычно получают не ранее, чем через 2 - 2,5 месяца после посева материала. При определении лекарственной устойчивости микобактерий на плотных средах культура считается чувствительной к той концентрации препарата, которая содержится в среде, если число колоний микобактерий, выросших на одной пробирке с препаратом, не превышает 20, а посевная доза соответствует 1-107 микробных тел. Культура расценивается как устойчивая к данной концентрации препарата только при наличии в пробирке с этой концентрацией 20 колоний и более при обильном росте в контрольной пробирке, не содержащей лекарственного препарата.
Разведение противотуберкулезных препаратов и приготовление питательных сред
В питательную среду Левенштейна-Йенсена, не содержащую крахмала (крахмал адсорбирует лекарственные препараты), непосредственно перед свертыванием добавляли рабочие разведения противотуберкулезных препаратов первого ряда в указанных концентрациях. Для приготовления питательных сред с целью определения лекарственной устойчивости микобактерий использовались химически чистые субстанции противотуберкулезных препаратов (Sigma-Aldrich INC). Для приготовления из химически чистой порошковидной формы препарата рабочих растворов, содержащих необходимые для исследования концентрации активной субстанции, расчеты производили с учетом процента активности препарата.Активность препарата может варьировать от одной его серии к другой серии. Сведения об активности приводятся на этикетках или упаковках лекарственных препаратов. Взвешивание производили на электронных весах с точностью до четвертого знака после запятой.
Определение лекарственной устойчивости методом абсолютных концентраций.
Непосредственно перед постановкой опыта по определению лекарственной устойчивости убедились в том, что отобранные для исследования культуры микобактерий не загрязнены посторонней микрофлорой. Проверенные и отобранные для постановки опыта культуры микобактерий расставляли в штативе в порядке номеров. При определении чувствительности микобактерий к противотуберкулезным препаратам каждую серию приготовленной питательной среды с препаратами проверяли, засевая на нее заведомо чувствительную культуру микобактерий туберкулеза (справочный штамм лаборатории, H37Rv). Контрольную культуру засеяли так же, как и испытуемые. Если среда с препаратами приготовлена правильно, то контрольная культура не должна расти при тех концентрациях препаратов, при которых не растут чувствительные к данному препарату штаммы. Появление роста контрольного штамма в пробирке спрепаратом указывает на то, что при приготовлении среды с препаратами допущена ошибка или на то, что неправильно приготовлена бактериальная суспензия.