Материалы и методы исследования

. Обрабатывали рабочим раствором солянокислого спирта до полного визуального обесцвечивания (1-3 минуты).

. Промывали в воде.

. Докрашивали (несколько капель) метиленовым синим 1-2 минуты.

. Основательно споласкивали в воде и высушивали фильтровальной бумагой.

Окрашенные мазки исследовали в масле, с иммерсионным объективом.

Выделение чистой культуры осуществляли традиционным способом _ посевом на плотную питательную среду Левенштейна-Йенсена.

Реактивы

· Калий однозамещенный фосфорнокислый KH2PO4.

· Магний лимоннокислый Mg3(C6H5O7)2 × 14H2O.

· Магний сернокислый MgSO4 × 7H2O.

· L-аспарагин C4H8N2O3 × H2O.

· Глицерин C3H8O3.

· Малахитовый зеленый C52H54O12N4.

· Вода дистиллированная.

Состав среды

) Приготовлениераствора минеральных солей:

· Калий однозамещенный фосфорнокислый 2,4 г

· Магний лимоннокислый 0,6 г

· Магний сернокислый 0,24 г

· L-аспарагин 3,6 г

· Глицерин 12,0 мл

· Вода дистиллированная 600 мл

Вышеперечисленные ингредиенты растворяли в теплой дистиллированной воде вуказанной последовательности при слабом подогревании (не доводя до кипения) наводяной бане. L-аспарагин растворяли отдельно и вносили последним.

Затем солевой раствор стерилизовали в автоклаве при 1 атм. (121 °С) в течение 30 минут. Срок хранения раствора составляет 3-4 недели при комнатной температуре.

)Приготовление раствора малахитового зеленого:

· Малахитовый зеленый 2 г

· Стерильная дистиллированная вода 100 мл

Взвешенный порошок малахитового зеленого растворяли в стерильной теплой дистиллированной воде и помещали раствор втермостат на 2 часа для большего растворения (часто помешивали, поскольку порошок растворяется очень плохо). Затем профильтровывали растворчерез бумажный фильтр, разливали по флаконам и стерилизовали при 1 атм. (121 °С) в течение 30 минут.

)Приготовление яичной массы.

Свежие диетические куриные яйца без трещин и дефектов скорлупы тщательномыли в теплой проточной воде с помощью ручных щеток и щелочного мыла.Далее яйца тщательно промывали в проточной воде и погружали в 70% этиловыйспирт на 30 минут.

Тщательно мыли руки с мылом и щеткой. Затем в стерильном боксе разбивали яйца стерильным ножом в стерильную посуду, доведя общий объем яичной массы до 1 л.

Тщательно взбивали яичную массу стерильным венчиком при минимальной скорости.

Приготовление среды

В большую стерильную емкость, соблюдая правила стерильности, помещали следующие растворы:

. раствор минеральных солей 600 мл;

. гомогенизированную яичную массу 1000 мл.

Смесь тщательно перемешивали и профильтровывали через стерильный марлевыйфильтр, имеющий не менее 4 слоев марли. Добавляли 20 мл раствора малахитовогозеленого, тщательно перемешивали, избегая образования пены, и в течение 15 минутразливали в пробирки приблизительно по 5 мл, следя за тем, чтобы в растворе не сформировался осадок.

Свертывание среды:

Для свертывания среды использовали специальные аппараты-свертыватели«АСПС». Пробирки с разлитой в них средой помещали в специальные штативы сподобранным углом наклона для формирования косяка среды высотой 8-10 см. Штативы устанавливали в свертыватель и проводили коагуляцию при 82-83 °С в течение40 минут.

В работе использовался коммерческий набор для деконтаминации-разжижения BBL™ Mycoprep™, в который входит: NaOH- 20.0г; Na3C6H5O7X2H2O(три натрий цитрат)-14.5г;

Каждая ампула содержит NALC(C5H9NO3S) - 0.375г Буфер: Na2HPO4 - 2.37г; KH2PO4-2.27г. Конечная pH=6.8

Процедура:

· Готовили BBL™ Mycoprep™ фосфатный буфер, путем растворения одного пакета в 500 мл дистиллированной воды, автоклавировали при 1210С 15 минут;

· ослабив винтовую крышку флакона BBL™ Mycoprep™ реагента, фиксировали ампулу внутри флакона и сламывали еесжатием. Слегка встряхивали для растворения NALC;

· в ламинарном боксе, используя стерильную центрифужную пробирку, переносили в нее равные количества исследуемого материала и NALC- NaOH (по 10 мл);

· закрывали пробирку и перемешивали на вортекс-миксере;

· оставляли смесь при комнатной температуре на 15 минут;

· добавляли подготовленный фосфатный буфер до 50-мл отметки на пробирке и смешивали. Центрифугировали в течение 15 минут при ускорении 3000 g;