Материалы и методы исследования

· осторожно сливали надосадочную жидкость, добавляли малое количество фосфатного буфера с рН=6.8 (от 0.5 до 2.0 мл) и ресуспендировали осадок.

Техника посева и инкубации

Достоверная клиническая интерпретация результатов микробиологического исследования достигается при обязательном соблюдении следующего правила: микроскопическое и культуральное исследования должны производиться параллельно только из одной и той же пробы диагностического материала.

· набирали стерильной мерной пипеткой 1,0 - 1,2 мл полученного после обработки и нейтрализации осадка, оставив приблизительно 0,2 мл для последующего приготовления мазка для микроскопии;

· вносили равные объемы набранного обработанного материала (примерно по 0,5 - 0,6 мл) в 2 пробирки со средой Левенштейна-Йенсена, материал же, обработанный при помощи NALC- NaOH засевали на косяки агараМиддлбрук 7Н10 и в пробирки MGIT.

Остаток осадка забирали той же пипеткой и наносили на подготовленные и пронумерованные предметные стекла 1-2 капли осадка для получения мазка; подготовленные мазки оставляли сушиться на воздухе, после чего фиксировали их троекратным проведением в пламени и окрашивали по Циль-Нильсену.

По завершении посева всех проб засеянные пробирки с плотными средами перемещали в горизонтальные штативы - диваны и помещали в термостат при температуре 37°С. При посеве на агары и в бульон Миддлбрук чашки Петри и пробирки герметично упаковывали в автоклавные пакеты, пробки пробирок оставляли слегка отпущенными.

Детекция роста микобактерий с помощью автоматизированной системы бульонного культивирования BACTECMGIT 960

Посев диагностического материала в пробирки MGIT

Инокуляция осадка обработанного материала в индикаторные пробирки MGIT проводили с помощью стерильной пипетки в условиях стерильности:

· снимали откручивающуюся крышку с пробирки MGIT;

· добавляли содержимое флакона с обогатительной добавкой OADC (15 мл) во флакон с лиофилизированными антибиотиками PANTA;

· переносили 0,8 мл смеси PANTA /OADC в пробирку MGIT;

· вносили 0,5 мл осадка диагностического материала в пробирку MGIT и параллельно производили посев 0,2-0,5 мл материала на плотную среду Левенштейна-Йенсена;

· убедившись, что пробка плотно закручена, производили загрузку пробирки в прибор ВАСТЕС 960 в соответствии с инструкцией по эксплуатации.

Инкубация пробирок в системе

1. Открывали один из ящиков прибора ВАСТЕС MGIT 960 и нажимали появившуюся на экране кнопку «tubeenter» («Загрузка пробирки»). При этом загорается лампа сканера для считывания штрих-кода с пробирки.

. Считывали сканером штрих-код пробирки с инокулятом и устанавливали ее в гнездо, рекомендуемое прибором.

. Ежедневно проверяли показания прибора на предмет появления положительных и отрицательных результатов.

. О положительном результате (рост микобактерий) свидетельствовал красный сигнал положительного индикатора на соответствующем ящике и значок на дисплее прибора.

. При появлении информации о положительном результате открывали указанный ящик, нажимали появившуюся на экране кнопку «positive», извлекали соответствующую пробирку из гнезда (вместо красной индикации, указывавшей непосредственно на место «положительной» пробирки, появляется зеленая, указывающая на освободившееся гнездо) и сканировали штрих-код.

. Пробирки, рост микобактерий в которых не зафиксирован прибором в течение 42 дней, оценивались системой как отрицательные. Об отрицательном результате (отсутствие роста микобактерий) свидетельствовал зеленый сигнал отрицательного индикатора на соответствующем ящике и значок на дисплее прибора.

. При появлении информации об отрицательном результате открывали указанный ящик, нажимали появившуюся на экране кнопку «negative», извлекали указанную пробирку из гнезда и сканировали ее штрих-код.

Оценка результатов культивирования на автоматизированной системе

Положительный результат, свидетельствующий о росте культуры в индикаторной пробирке, регистрировали с 4-го дня после инокуляции, положительный сигнал в 1-3-е сутки может быть расценен как микробная контаминация образца. Для подтверждения роста микобактерий, а также идентификации МБТ в позитивной пробирке проводили следующие процедуры:удалив позитивную или негативную пробирку из прибора, визуально оценивали прозрачность бульонной среды для определения возможного роста микобактерий. Обычно рост культуры МБТ проявляется в виде характерных придонно расположенных хлопьев, которые при незначительном встряхивании поднимаются и распространяются по всей среде, при этом жидкая среда сохраняет прозрачность. Помутнение среды в позитивной пробирке свидетельствует о возможной контаминации посторонней флорой.