Материалы и методы исследования

За период 2008-2011 гг. было проведено 3979 посевов клинических изолятов мокроты, полученных от пациентов, находившихся на лечении в Минском областном противотуберкулезном диспансере с диагнозом туберкулеза легких, с целью получения культур микобактерий туберкулеза.

Перед посевом клинического материала на питательную среду с целью выделения культуры M.tuberculosis проводилась обработка материала миколитическими разжижающими веществами с целью удаления белковых масс, деконтаминация образца с целью удаления сопутствующей бактериальной флоры и центрифугирование. Содержимое центрифужной пробирки использовалось для микроскопии и посева на: Смартфоны samsung 128.

а) плотную яичную среду (Левенштейна-Йенсена);

б) агаровую среду ( Миддлбрук 7Н10);

в) систему бульонного культивирования (MGIT).

Затем проводилась инкубация, оценка и учет результатов посева диагностического материала. Для гомогенизации и деконтаминации диагностического материала использовались стандартные методы разжижения и деконтаминации: обработка материала 10% трехзамещенным фосфорнокислым натрием.

Методика обработки:

. Исследуемый материал заливали равным объемом 10% трехзамещенного фосфата натрия, плотно закрывали емкость и помещали ее на 10 минут на встряхиватель.

. Пробирку с материалом, залитым деконтаминантом, помещали на 20 часов в термостат при 37 °C.

. После этого пробирки, не открывая, уравновешивали, помещали в соответствующую центрифугу и центрифугировали при 3000 g в течение 15 минут. При указанном режиме происходит осаждение 95% присутствующих в материале микобактерий.

. Надосадочную жидкость отбирали стерильной пипеткой на 5-10 мл и переносили ее в емкость с дезинфицирующим раствором, оставляя в каждой пробирке 1,2-1,5 мл осадка.

. Использованную пипетку опускали в емкость с дезинфицирующим раствором.

. К осадку стерильно добавляли несколько капель 6% соляной кислоты до получения нейтрального значения рН, определяемого индикаторной бумажной полоской.

. Пробирку с осадком помещали в штатив в порядке регистрационных номеров материала.

. Для снижения токсичного воздействия на микобактерии различных остатков веществ (в том числе возможных химиопрепаратов) проводили еще одну процедуру отмывки осадка 10-15 мл дистиллированной воды.

Супернатант удаляли, а осадок в объеме 0,8-1,0 мл готовили к инокулированию и приготовлению мазка:

Реактивы

. Трехзамещенный фосфорнокислый натрий (Na3PO4).

. Кислота соляная (HCl) концентрированная.

. Бумага индикаторная универсальная.

Приготовление растворов

1. 100 г трехзамещенного фосфата натрия растворяли в 800 мл дистиллированной воды и доводили объем раствора до 1 л.

. 6 мл концентрированной соляной кислоты добавляли к 94 мл дистиллированной воды.

Первой ступенью идентификации является микроскопия всех выделенных культур с окраской мазков по Цилю-Нильсену.

Реагенты

. Карболовый фуксин Циля 1 фл (100 мл)

. Солянокислый спирт (концентрат) 1 фл (10 мл)

. Метиленовый синий 1 фл (100мл)

Набор обеспечивает 200 исследований (при расходе 0,5 мл реагента на одно исследование).

Подготовка к анализу

Предметные стекла перед проведением исследования тщательно мыли и обезжиривали смесью для обезжиривания предметных стекол производства «АБРИС+».

Полученные мазки тщательно высушивали и затем фиксировали сухим жаром. Фиксация достигается посредством несильного нагревания (примерно до 700С) предметного стекла, которое для этого трижды провели над пламенемспиртовки мазком вверх.

Приготовление рабочего растворасолянокислого спирта.

Для приготовления рабочего (3%) раствора солянокислого спирта, во флакон емкостью 100 мл вносили концентрат солянокислого спирта (10 мл) и добавляли 90 мл этилового спирта (960). Раствор тщательно перемешивали.

Методика окраски:

. Помещали на мазок полоску фильтровальной бумаги и наносили на фиксированный мазок несколько капель карбол-фуксинЦиля и подогревали над пламенем спиртовки до появления паров. Эту температуру поддерживали в течение 1-2 минуты, не доводя до кипения. Охлаждали мазок до комнатной температуры.

. Сливали краску, удаляли фильтровальную бумагу и основательно промывали в водопроводной воде.