Определение гомологичных участков и компьютерное моделирование вторичной структуры индивидуальных 2'-F-модифицированных РНК-аптамеров фракций I, II и III

Цветами отмечены: … - 5'-константный участок РНК-библиотеки, … - 3'-константный участок РНК-библиотеки, … - 40N-участок РНК-библиотеки, N - 2'-F-модифицированные пиримидиновые нуклеотиды.

Рис. 26. Вторичные структуры 2'-F- модифицированных РНК-аптамеров фракции I, полученные компьютерным моделированием в программном пакете mfold version 2.3. Условия моделирования: 22°C, 1М NaCl. Аптамер 1 dG = -38,99 ккал/моль, аптамер 2 dG = -38,54 ккал/моль, аптамер 3 dG = -43,59 ккал/моль, аптамер 4 dG = -41,08 ккал/моль.

Рис. 27. Вторичные структуры 2'-F-модифицированных РНК-аптамеров фракции II, полученные в программном пакете mfold version 2.3. Условия моделирования: 22°C, 1М NaCl. Аптамер 1 dG = -42,43 ккал/моль, аптамер 2 dG = -41,17 ккал/моль, аптамер 3 dG = -40,75 ккал/моль, аптамер 4 dG = -42,03 ккал/моль, аптамер 5 dG = -36,37 ккал/моль.

Таблица 8. Цветовая схема вероятности нахождения нуклеотидной последовательности в одноцепочечном состоянии.

Как видно из рис. 26, 27, 28, все клоны обладают сложной вторичной структурой, что коррелирует с литературными данными. Среди представленных клонов встречаются олигонуклеотиды, обладающие схожей вторичной структурой: фракция I, клон 2 и фракция III, клон 4, обладающие сходной нуклеотидной последовательностью; фракция II, клон 5 и фракция III, клон 6, обладающие сходной нуклеотидной последовательностью; фракция I, клоны 3 и 4, не обладающие сходством нуклеотидной последовательности. Полученный результат свидетельствует о том, что, в случае клона 5, фракция II и клона 6, фракция III, введение одного нуклеотида и замена одного нуклеотида в последовательности привели к изменению сродства 2'-F-РНК к мишени. Это дает возможность предположить, что участок вышеуказанных изменений (петля с 25 по 37 нт) играет роль в связывании поликлональных аутоантител человека, больного РС.

Для определения участков, важных для связывания аутоантител, гомологичные участки, полученные отдельно для клонов каждой фракции, были выделены на вторичных структурах 2'-F-модифицированных РНК-аптамеров. При этом было выявлено, что часть полученных гомологичных участков формирует схожие вторичные структуры в разных 2'-F-модифицированных РНК-аптамерах. Это позволяет предположить, что данные гомологичные участки участвуют в связывании поликлональных аутоантител человека, больного РС.

Таким образом, в данной работе впервые показана возможность получения 2'-F-пиримидинсодержащих РНК-аптамеров, обладающих ингибирующей активностью по отношению к поликлональным аутоантителам человека, больного рассеянным склерозом. В дальнейшем предполагается синтезировать индивидуальные 2'-F-пиримидинсодержащие РНК-аптамеры и изучить их мишень-связывающие и ингибирующие свойства, с целью использования в будущем в качестве основы для создания перспективных средств диагностики и лечения рассеянного склероза.

Выводы

. Оптимизирована и апробирована методика отбора 2'-F-модифицированных РНК-аптамеров к поликлональным аутоантителам, вырабатываемым организмом человека при рассеянном склерозе. Показано, что предложенная методика позволяет проводить обогащение комбинаторной 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки последовательностями, обладающими повышенным сродством к патогенным антителам.

. Исследовано влияние 2'-F-пиримидинсодержащей РНК-библиотеки после 10-го раунда SELEX на протеазную активность аутоантител. Показано, что 2'-F-модифицированная РНК-библиотека после 10-го раунда отбора ингибирует деградацию ОБМ аутоантителами.