Методы исследования

Из полученных рабочих растворов отобрать пробы по 0.1 мл и провести цветную реакцию по прописи. На оси абсцисс откладываем концентрацию белка в мкг, на оси ординат - величину экстинции и строим кривую.

Норма белка в ткани: 100-200 мг/г ткани.

Определение активности тирозинаминотрансферазы по методу Шепарда [18]

Для определения активности тирозинаминотрансферазы (ТАТ) брали 1 гр печени крыс и гамогенезировали в 4 мл К-фосфатного буфера (рН=7,6).

Реактивы:

1. L-Тирозин

2. α-Кетоглутаровая кислота

. Диэтилдитиокарбамат

. Пиридоксальфосфат

. Феназинметасульфат

. 0,75 М фосфатный буфер рН=7,0 (готовят перед опытом)

. 0,14М KCl фосфатный буфер рН=7,6

Метод:

Активность тирозинаминотрансферазы исследуется по определению увеличения концентрации р-оксифенилпирувата в инкубированных образцах (контроль - при нулевой температуре), измеряя экстинцию окраски, образующейся при взаимодействии этого метаболита с феназинметасультфатом. Смесь для определения активности содержит 0,1 мл печеночной фракции, 6 ммолей L-тирозина, 0,1 ммоль пиридоксальфосфата, 5 ммолей α-кетоглутаровой кислоты и 100 ммолей фосфатного буфера (рН=7,6), в общем объеме 3 мл, депротеинировали, добавляя 1,0 мл 20% фосфорной кислоты при t=-0 C (контроль) и после 20-минутной инкубации при t=-37 C (опыт). 1,0 мл депротеинированных смесей добавляли к 4 мл раствора феназинметасульфата рН=7,0. После 1 ч развития окраски при комнатной температуре в месте, защищенном от световых лучей, измеряли поглощение света на ФЭКе при длине волны 670нм, кювета толщиной 10,0 мм.

Активность фермента выражается в единицах (нмоли образовавшегося р-оксифенилпирувата/мин при условиях инкубации) на мг белка.

Расчет активности фермента:

Тканевая активность (мкмоль/мин на 1гр ткани):

А=10,25*а,

где а-мкмоль р-ОПФ в пробе,

,25 - коэффициент, учитывающий разведение и перевод полученных данных в мкмоль на 1 г ткани печени за 1 мин.

Удельная активность (нмоль/мин на мг белка):

С=А/В,

где А-тканевая активность, мкмоль/мин на гр ткани,

В-количество мг белка на 1 г ткани печени.

Определение количества SH-групп в печени, почках, сердце и мозге крыс методом Фоломеева [18]

Количество сульфгидрильных групп определяли методом Фоломеева в модификации. Фотоколориметрический ультрамикрометод количественного определения сульфгидрильных групп белка и небелковых соединений.

Принцип метода:

Метод основан на эквивалентном взаимодействии молекулярного йода со свободными SH-группами белков и низкомолекулярных соединений в присутствии 3М KI, а также фосфатного буфера рН=7,6, при температуре среды более 20С. О количестве йода, прореагировавшего с SH-группами, судят по результатам сравнения опытной и контрольной проб на фотоэлектроколориметре (ФЭК).

Реактивы:

1. 3М KI (готовят перед опытом)

2. 5% раствор крахмала (готовят каждый день)

. 0,1н раствор I2(готовят раз в неделю)

. 0,001н раствор I2 (готовят из 0,1н раствора I: 0,1 мл 0,1н раствора I +9,9мл Н2О)

. 0,14 М KCl фостфатный буфер рН=7,6

. 7% ТХУ

Ход работы:

Определение общих сульфгидрильных групп:

К 0,1 мл супернатанта (20% гомогенат печени) добавляют 2мл 3М KI, 0,1 мл 5% раствора крахмала и 3 мл фосфатного буфера рН=7,6 (общий объем равен 5, 2 мл). Пробу перемешивают и в кювете с длиной оптического пути 10 мм и помещают в ФЭК против контрольной пробы. Стрелку гальванометра и шкалу экстинций устанавливают на нуле. Затем в пробу вносят 0,1 мл 0,001н раствора I2, тщательно перемешивают и колориметрируют через 10с после внесения йода в пробу. Длина волны 490нм. Контрольную пробу на реактивы колориметрируют аналогично. О количестве SH-групп в пробе судят по количеству йода (в эквивалентах), взаимодействующего с тиогруппами.