Экспериментальная часть

Исходные материалы

В работе были использованы следующие реактивы и растворители: спермидин гидрохлорид (CALBiochem, США), N-метилимидазол (N-MeIm), дитиотреит (DTT), акриламид, N,N'-метиленбисакриламид (Acros Organics, Бельгия), додецилсульфат натрия (Life Technologies, США), 5'-O-диметокситритил-N6-бензоилдезоксирибоаденозин-3'-N,N-диизопропил-(2-цианэтил)-фосфитамид (dA-CE), 5'-O-диметокситритил-N4-ацетилдезоксирибоцитидин-3'-N,N-диизопропил-(2-цианэтил)-фосфитамид (dC-CE), 5'-O-диметокситритил-N2-изобутирилдезоксирибогуанозин-3'-N,N-диизопропил-(2-цианэтил)-фосфитамид (dG-CE), 5'-O-диметокситритилтимидин-3'-N,N-диизопропил-(2-цианэтил)-фосфитамид (dT-CE), полимерный носитель CPG с присоединенным 5'-O-диметокситритил-N4-ацетилдезоксирибоцитидином (Glen Research, США), Твин 20, перхлорат натрия, персульфат аммония, краситель “Stains-Аll”, полиэтиленгликоль 8000, хлорид магния, этилтиотетразол, трис(гидроксиметил)аминометан (Sigma-Aldrich, США), тетрагидрофуран (THF), пиридин (Py) (Panreac, Испания), мочевина, 40%-ный водный метиламин (Merck, Германия), бромид этидия, 2,6-лутидин, ксиленцианол FF, бромфеноловый синий, Тритон X-100 (Serva, Германия), дихлоруксусная кислота (DCA), N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамин, хлорид калия (Fluka, Швейцария), триптон, дрожжевой экстракт, агар, агароза LE 2 (Helicon, Россия), ампициллин (Gibco, США), Na2EDTA (Amresco, США), γ-[32P]-ATP (4000 Ки/моль, “Биосан”, Россия), 2'-F-UTP, 2'-F-СTP (НаноТех-С, Россия), ацетонитрил (ос. ч.), диметилсульфоксид (ос. ч.), гидрокарбонат натрия (ос.ч.), карбонат натрия (ос.ч.) и другие реактивы и растворители отечественного и импортного производства. Безводные растворители готовили с использованием стандартных методов. Изопропилтиогалактозид (IPTG) (Сибэнзим, Россия) был любезно предоставлен д.б.н. Жарковым Д.О. (ИХБФМ СО РАН). X-Gal (Kramel Biotech, Великобритания) был любезно предоставлен Храповым Е.А. (ИХБФМ СО РАН).

Для ферментативных реакций использовали полинуклеотидкиназу фага Т4 (КФ 2.7.1.78), РНК-полимеразу фага Т7 (КФ 2.7.7.6), бактериальную щелочную фосфатазу (КФ 3.1.3.1), обратную транскриптазу вируса птичьего миелобластоза (КФ 2.7.7.49), ДНКазу I (КФ 3.1.4.5), фрагмент Кленова ДНК-полимеразы E.coli (КФ 2.7.7.7), эндонуклеазы рестрикции BamHI, HindIII, Pst I (КФ 3.1.4.30), ДНК-лигазу фага Т4 (КФ 6.5.1.1) (Fermentas, Литва), Taq ДНК-полимеразу (КФ 2.7.7.7) (“Биосан”, Россия).

Набор для секвенирования ДНК Big Dye Terminators v.3.1. Cycle Sequencing Kit был любезно предоставлен ЦКП “Секвенирование ДНК” СО РАН.

Для измерения констант диссоциации комплексов аутоантител и 2'-F-РНК использовали нитроцеллюлозные фильтры MF-MilliporeTM с размером пор 0.45 мкм (Millipore, Ирландия).

Олигодезоксирибонуклеотиды-праймеры dm 28, dm 28 long, dm 29, HindIII, BamHI, seq 1, seq 2 (табл. 2) были синтезированы в ЛХРНК ИХБФМ СО РАН Мещаниновой М.И. на синтезаторе ASM-800 («Биоссет», Россия) с использованием протокола операций твердофазного фосфитамидного синтеза, оптимизированного для данного прибора. Праймер M13 reverse был любезно предоставлен к.б.н. Морозовым И.В. (ИХБФМ СО РАН).

Таблица 2. Олигодезоксирибонуклеотиды, использованные в работе