Получение соответствующего фрагмента нуклеиновой кислоты

Важным достоинством рассматриваемого метода является и то, что в результате гидролиза РНК рибонуклеазой Н образуются фрагменты, у одного из которых на 5'-конце содержится фосфатная группа, а у другого 3'-конец свободен (нефосфорилирован). Такие фрагменты можно прямо использовать в реакции ферментативного лигирования.

Серьезным ограничением этого метода является то, что участок РНК, с которым связывается комплементарный ему олигодезоксирибонуклеотид, должен иметь однотяжевую конформацию и находиться на поверхности макромолекулы РНК, представляющей собой в условиях расщепления компактную глобулу с развитой вторичной структурой. В отдельных случаях это ограничение удается преодолеть, используя достаточно длинные олигодезоксирибонуклеотиды (15-20-членные), которые предварительно отжигают с частично или полностью денатурированной РНК.

Другое ограничение метода фрагментации полирибонуклеотидов РНКазой Н в присутствии комплементарных олигодезоксирибонуклеотидов заключается в том, что в общем случае предсказать, какая из фосфодиэфирных связей в гетеродуплексе (или в непосредственной близости от него) подвергнется расщеплению, не удается. Более того, фермент зачастую гидролизует не одну, а несколько соседних межнуклеотидных связей. Ясно, что для последующего конструирования рекомбинантных РНК такие фрагменты могут оказаться непригодными.

Расщепление РНК может проводиться и с участием нуклеаз, ковалентно связанных с олигонуклеотидами. Идея, лежащая в основе данного подхода к направленной фрагментации РНК, восходит к концу 60-х годов, когда Н.И. Гриневой и ее сотрудниками был предложен метод олигонуклеотид-направляемой модификации нуклеиновых кислот. Принцип этого метода заключается в том, что с 5'- или 3'-концевым остатком олигонуклеотида, комплементарного заданному району ДНК и РНК, связывают модифицирующий агент, который после образования дуплекса атакует одно из ближайших к нему оснований. Реагентами этого типа удалось направленно фрагментировать фенилаланиновую тРНК из дрожжей, РНК-компонент (M1 РНК) РНКазы Р, а также 16S рибосомную РНК E.coli.

Однако, как и в случае РНКазы Н, расщепление РНК олигонуклеотид-нуклеазой зачастую проходит по нескольким межнуклеотидным связям, что несколько ограничивает возможности применения этого метода для получения рекомбинантных РНК.

Для расщепления РНК применяют также рибозимы (природные РНК и синтетические полирибонуклеотиды, способные катализировать целый ряд превращений у других РНК). Первый рибозим, напоминающий по своим свойствам эндонуклеазы рестрикции, был получен Т. Чеком. В научной литературе его обозначают как рибозим L-19. Этот рибозим представляет собой РНК длиной в 395 нуклеотидных остатков, в 5'-концевой области которой имеется гексануклеотидная последовательность GGAGGG, ответственная за специфичность расщепления предшественника 26S РНК при самосплайсинге. Эта последовательность комплементарна CUCUCU последовательности, расположенной на 3'-конце первого экзонного участка предшественника 26S РНК. Если эту РНК заменить другой, но обязательно содержащей доступную для комплементарного связывания CUCUCUA последовательность, то рибозим L-19 в присутствии гуанозина или гуаниловых нуклеотидов со свободной 3'-гидроксильной группой расщепит ее.

Источником необходимых участков РНК может служить такой способ, как синтез фрагментов РНК. Ферментативный синтез сегментов РНК осуществляют с использованием разнообразных генно-инженерных конструкций. Однако в настоящее время в подавляющем большинстве случаев для препаративного получения РНК используются РНК-полимеразы, закодированные в геномах ряда ДНК-содержащих бактериофагов (Т3, Т7 и SP6). Они характеризуются очень высокой активностью и, в отличие от клеточных РНК-полимераз, состоят из одной полипептидной цепи. Важно также то, что инициация и терминация синтеза РНК этими полимеразами происходит на одном определенном нуклеотидном остатке.