Электрофорез белков в ПААГ

Электрофорез белков в денатурирующих условиях проводили в полиакриламидном геле (система Laemmli.).В качестве маркеров молекулярных масс использовали набор “Kalibration kit": молекулярный вес - 14.4, 20.1, 30.0, 43.0, 67.0, 94.0 кДа (Pharmacia).

Использовали двухступенчатый гель: верхний (концентрирующий) - 3,5% ПААГ в буфере UTB, нижний (разделяющий) - 15% ПААГ в буфере LTB с инициатором полимеризации персульфата аммония (1/100 объема геля) катализатором полимеризации и TEMED (1/1000 объема). Размер и толщина геля определялся размерами стёкл, толщиной спейсеров и составлял 9х12х0,05 см.

Электрофорез проводили в 1х трис-глициновом буфере с SDS при постоянном силе тока в 22 мА. Электрофорез прекращали, когда фронт красителя бромфенолового синего не выходил в буфер. Затем гель помещали на 15 минут в фиксирующий раствор (10% ТХУ, 10% метанол), потом - на 15 минут в красящий раствор (0,2% Кумаси R-250, 10% уксусной кислоты, 10% изопропанола) при 60єС. Краску геля отмывали кипячением в 5%-ом растворе уксусной кислоты.

Определение концентрации белка методом Бредфорд

Реактив Бредфорд готовили следующим образом: кумасси бриллиантовый синий G-250 (100 мг) растворяли в 50 мл 95% - ного EtOH. К полуяеному раствору добавили 100 мл 85%-ной фосфорной кислоты и водой довили объём смеси до 1л.

К анализируемому образцу, содержащему белок в диапазоне 0,5 -9 мг/мл добавили 2,5 мл реагента-красителя и хорошо перемешали. Измеряли поглощение при длине волны 595 нм относительно чистого реагента.

Концентрацию белка находили по градуировочному графику построенному по БСА.