Хроматографическое разделение 2'-F-пиримидинсодержащей РНК-библиотеки после 10-го раунда отбора на фракции по сродству к поликлональным аутоантителам

Для выделения фракции 2'-F-модифицированных олигорибонуклеотидов, обладающей наибольшим сродством к патогенным аутоантителам и/или ингибирующей активностью по отношению к аутоантителам, часть полученной после 10-го раунда отбора 2'-F-пиримидинсодержащей РНК-библиотеки была амплифицирована до 3.55 о.е. и разделена хроматографически на колонке с иммобилизованным на BrCN-активированной сефарозе пулом поликлональных аутоантител. Цифрами I, II и III отмечены объединенные фракции 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки (рис. 16).

Рис. 16. Хроматографическое разделение 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки после 10-го раунда SELEX по сродству к поликлональным аутоантителам. На колонку наносили 3.55 о.е. 2'-F-РНК библиотеки в 60 мкл бидистиллированной воды и промывали 20 мМ Tрис-HCl, pH 7.5 (фр. 1). Далее проводили ступенчатую элюцию 2'-F-РНК растворами следующего состава: 0.1 М NaCl в 20 мМ Tрис-HCl, pH 7.5 (фр. 2); 0.3 М NaCl в 20 мМ Tрис-HCl, pH 7.5 (фр. 3); 0.5 М NaCl в 20 мМ Tрис-HCl, pH 7.5 (фр. 4); 1 М NaCl в 20 мМ Tрис-HCl, pH 7.5 (фр. 5); 2 М NaCl в 20 мМ Tрис-HCl, pH 7.5 (фр. 6); 3 М NaCl в 20 мМ Tрис-HCl, pH 7.5 (фр. 7); 1 М MgCl2 в 20 мМ Tрис-HCl, pH 7.5 (фр. 8); 2 М MgCl2 в 20 мМ Tрис-HCl, pH 7.5 (фр. 9); 3 М MgCl2 в 20 мМ Tрис-HCl, pH 7.5 (фр. 10); 0.1 М глицином, pH 2.6 (фр. 11). Цифрами I, II и III отмечены объединенные фракции 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки.

Фракции I, II и III 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки после хроматографического разделения обессолили и сконцентрировали на колонках Microcon YM-30 (условия приведены в п. 2.3.10.). Количество 2'-F-РНК во фракции I составило 2,5 о.е. (4 нмоль). Фракции II и III 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки амплифицировали как описано в п. 2.3.5., получив в среднем по 0.7 о.е. (1 нмоль) каждой фракции.

Было исследовано влияние каждой фракции 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки на реакцию деградации ОБМ аутоантителами, вырабатываемыми организмом человека при рассеянном склерозе (рис. 17).

1) 2)

Рис. 17. Ингибирование протеазной активности аутоантител фракциями 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки после хроматографического разделения: 1) индивидуальными фракциями, 2) комбинациями фракций. Каждая реакционная смесь (12 мкл) содержала 6 мкг ОБМ, 6 мкг аутоантител, 17 мМ Трис-HCl (pH 7.5), 17 мМ NaCl. Концентрация 2'-F-РНК библиотеки в реакционных смесях для каждой фракции составила 0 мкМ, 0.1 мкМ, 0.3 мкМ, 0.5 мкМ, 1 мкМ, 3 мкМ, 5 мкМ и 7 мкМ. Реакцию деградации ОБМ проводили при 30°С в течение 24 ч. Реакционные смеси анализировали гель-электрофорезом в 12%-ном ПААГ с последующим окрашиванием Coomassie Blue R-250. Данные получены в ЛФР ИХБФМ СО РАН Безугловой А.М.

Исходя из полученных данных, можно сделать следующие выводы: ингибирующая активность 2'-F-модифицированных олигорибонуклеотидов не коррелирует с их сродством к поликлональным аутоантителам; каждая фракция 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки ингибирует определенную группу поликлональных аутоантител, вырабатываемых организмом человека при РС.

Для получения индивидуальных 2'-F-модифицированных РНК-аптамеров было проведено клонирование и секвенирование полученных фракций 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки.