Применение аптамеров

Аптамеры к белковым молекулам-мишеням широко применяются в различных областях молекулярной биологии и медицины. Способность аптамеров образовывать с молекулой-мишенью прочные комплексы позволяет использовать их в качестве средств детекции [22, 23, 85, 101-103], для очистки белков [104, 105], для исследования структуры белков и функций оцДНК и РНК в живой клетке [106-108], а также в качестве потенциальных терапевтических средств [25, 26, 109, 110].

Аптамеры в качестве средств детекции белков

На данный момент существует несколько различных систем детекции белков на основе аптамеров. Все их можно разделить на электрохимические, оптические и гравиметрические методы анализа.

Детекция белка электрохимическими методами основана на измерении разности электропроводности системы до введения белка и после. Электрохимические системы детекции бывают “односторонними” (single-site binding assay) [101, 111] и “двусторонними” (dual-site binding assay или sandwich assay) [85, 112]. Методы “одностороннего” анализа позволяют детектировать белок-мишень непосредственно при его взаимодействии с аптамером. Все они используют в качестве основы аптамеры, иммобилизованные на проводящей подложке: электроде [101, 111, 113], полипирроле [114], кремниевой подложке [115] или одностенной углеродной нанотрубке [116]. Для получения сигнала используют молекулы-репортеры - доноры или акцепторы электронов, такие как метиленовый синий [101, 114], гексацианоферраты 3+ /4+ [114], гексаамминорутенаты 3+ [117], ферроцен [113]. При этом молекула-репортер изначально либо находится вблизи проводящей подложки и сигнал наблюдается [101], либо удалена от него и сигнала нет [113]. После взаимодействия аптамера с мишенью его конформация меняется так, что происходит “переключение” - “выключение” или “включение” сигнала, соответственно. С использованием “односторонних” методов анализа созданы системы детекции α-тромбина человека [101, 111, 113, 116, 118], тромбоцитарного фактора роста BB (PDGF-BB) [114, 115], иммуноглобулина Е [114], лизоцима [117]. В случае “двусторонних” систем мишень детектируется по образованию тройного комплекса антитело-белок-аптамер или аптамер-белок-аптамер*, что повышает специфичность и чувствительность анализа. В последнем случае аптамеры должны связывать белок-мишень в разных неперекрывающихся участках. “Двусторонняя” система детекции состоит из молекулы-“захватчика”, аптамера [119, 120] или антитела [85, 112, 121-123], иммобилизованного на проводящей подложке, и молекулы-“детектора”, в качестве которых зачастую выступают аптамеры, модифицированные наночастицами металлов [120, 123, 124], ферментами [121] и целыми системами амплификации по типу “катящегося колеса” [122]. На основе “двусторонних” методов анализа созданы системы детекции α-тромбина человека [85, 120, 123], тромбоцитарного фактора роста BB (PDGF-BB) [112, 122], иммуноглобулина Е [121].

Оптические системы детекции белковых молекул-мишеней делятся на флуоресцентные и колориметрические методы анализа. Детекция флуоресценции используется довольно часто ввиду наличия большого числа различных флуорофоров и тушителей и легкости синтеза флуоресцентно меченых аптамеров. Такие аптамеры получили название сигнальных аптамеров. Одним из самых распространенных методов детекции является использование системы флуорофор-тушитель [125]. На данный момент такие системы анализа считаются полуколичественными. Другой тип флуоресцентных методов анализа основан на переносе энергии между флуоресцентными молекулами - донором и акцептором (FRET - fluorescence resonance energy transfer) [126]. При образовании комплекса аптамер-мишень происходит удалание или сближение донора и акцептора и появление или исчезновение сигнала, соответственно. Недостатком данного метода является его повышенная чувствительность, например, к природе красителя, длине спейсера, взаимодействию краситель-краситель и др. В связи с этим метод трудно применим в биологических средах из-за возрастания шумового сигнала. Использование пиренильных производных аптамеров также применяется для детекции белковых молекул-мишеней [127]. При связывании аптамера с белком-мишенью образуется пиренильный эксимер и происходит смещение максимума испускания флуоресценции с 400 нм до 485 нм. Однако данный метод также трудно применим для исследования сложных биологических проб из-за большого шумового сигнала. На основе флуоресцентных аптасенсоров были созданы системы детекции Tat белка ВИЧ [125], α-тромбина человека [126], тромбоцитарного фактора роста (PDGF) [127]. Колориметрические методы анализа белков базируются на аптамер-зависимой агрегации наночастиц золота [128-130]. Для определения тромбоцитарного фактора роста (PDGF) было предложено ковалентно иммобилизовать аптамер к PDGF на наночастицы золота [129]. При образовании комплексов аптамеров с белком-мишенью в условиях низкой концентрации мишени цвет раствора меняется от красного до розового. При средней концентрации белка образуется комплекс молекул PDGF и аптамеров, иммобилизованных на наночастицах, фиолетового цвета. В избытке белка раствор снова становится розовым из-за образования отдельных наночастиц золота, покрытых молекулами PDGF. С использованием ковалентно связанных с наночастицами аптамеров также была создана система детекции тромбина [130]. После связывания аптамера с мишенью происходит каталитическое увеличение размеров наночастиц золота в присутствии HAuCl4 и NADH, за счет которого происходит усиление сигнала. Аналогичная система с применением каталитического нанесения слоя серебра на наночастицы золота была применена для детекции тромбоцитарного фактора роста BB (PDGF-BB) [131]. Возможно также использование и нековалентного взаимодействия аптамеров с наночастицами золота [128]. Свободные молекулы аптамеров электростатически связываются с наночастицами золота и предотвращают их агрегацию. При образовании комплекса белок-аптамер свободные от аптамеров наночастицы агрегируют под действием солей.