Модификация аптамеров

К повышающим нуклеолитическую устойчивость олигонуклеотидов модификациям относится также замена атома кислорода в 4'-положении на серу в пиримидиновых нуклеотидах [80, 81] (рис. 4). С использованием 4'-тиомодифицированной РНК-библиотеки был получен РНК-аптамер к α-тромбину, содержащий 4'-S-U и 4'-S-C, который был в 50 раз более устойчив к деградации РНКазой A, чем немодифицированные РНК [81].

Весьма эффективно повышают устойчивость к нуклеазам модификации по межнуклеозидной фосфатной группе (рис. 5).

'-фосфоротиоат 5'-α-P-боранофосфат

Рис. 5. Модификации межнуклеозидной фосфатной группы в молекулах аптамеров.

Боранофосфатные межнуклеозидные мостики формируются природной Т7 РНК-полимеразой [82] или AmpliTaq ДНК-полимеразой [83] c использованием 5'-α-P-боранонуклеозидтрифосфатов в случае РНК- и ДНК-аптамеров, соответственно. Данная модификация значительно повышает стабильность аптамера. Другой удачной модификацией аптамеров является включение в их состав фосфоротиоатных межнуклеозидных мостиков [68, 84, 85]. Такие аптамеры являются высокоаффинными и существенно более устойчивыми к деградации нуклеазами. Недостатком фосфоротиоатмодифицированных олигонуклеотидов является их неспецифическое взаимодействие с белками in vivo [77].

По аналогии с природными процессами, одним из эффективных способов защиты НК от деградации экзонуклеазами является “кэпирование” (рис. 6). В качестве “кэпа” на 3'-конце олигонуклеотидов используют, например, концевую 3'-3' фосфодиэфирную связь (“инвертированный” тимидин) [50, 86], или биотиновый “кэп” [50, 87]. В качестве “кэпа” на 5'-конце используют полиэтиленгликоль [86] или тринуклеотидный “кэп”, присоединенный к аптамеру 5'-5'-межнуклеотидной связью [88]. При этом наличие “кэпа” не затрудняет связывание аптамера с молекулой-мишенью [86].

'-“Инвертированный” тимидин 5'-Полиэтиленгликоль

Рис. 6. Варианты 3'- и 5'- “кэпов” аптамеров.

Шпигельмеры (Spiegelmers) (“зеркальные” аналоги аптамеров, состоящие из L-нуклеотидов) - единственный тип аптамеров, устойчивый к деградации и эндо-, и экзонуклеазами [40]. Для отбора шпигельмеров используют комбинаторную библиотеку, состоящую из природных нуклеотидов, но в ходе отбора комбинаторную библиотеку инкубируют с белком-энантиомером белка-мишени. Полученные после отбора аптамеры синтезируют химически с использованием L-аналогов мономеров.