Метод SELEX

Отбору аптамеров in vitro к различным молекулам-мишеням посвящено множество обзоров [2, 3, 8, 30]. Отбор аптамеров проводят из комбинаторных библиотек олигонуклеотидов. Перед началом селекции проводят дизайн комбинаторной библиотеки, представляющей собой рандомизированный район, фланкированный двумя участками с фиксированной последовательностью (рис. 1).

Рис. 1. Комбинаторная библиотека олигонуклеотидов.

При дизайне комбинаторной библиотеки учитывают такие факторы, как тип библиотеки, длина рандомизированного участка, свойства константных районов. Рандомизированная часть комбинаторной библиотеки отвечает за формирование разнообразных пространственных структур. Константные участки необходимы для амплификации комбинаторной библиотеки. Чем больше длина рандомизированного района, тем больше число разнообразных пространственных структур, которые формирует библиотека. Однако рандомизированный район редко превышает 100 нт. Во-первых, при химическом синтезе комбинаторной библиотеки, чем больше ее длина, тем меньше конечный выход. Во-вторых, на первый раунд отбора берут от сотен пмолей до нескольких нмолей комбинаторной библиотеки, что составляет примерно от 1014 до 1016 разнообразных молекул. Это колчество молекул соответствует комбинаторной библиотеке с рандомизированным районом 25 нт (425 = 1015). Поэтому в случае протяженных комбинаторных библиотек в отборе принимает участие то же количество разнообразных молекул, что и в случае коротких комбинаторных библиотек. В последние годы наиболее часто используют комбинаторные библиотеки с рандомизированным районом длиной 30 - 40 нт.

Полученную химическим синтезом комбинаторную библиотеку инкубируют с молекулой-мишенью (рис. 2). Образовавшиеся комплексы отделяют от несвязавшихся молекул, разрушают и амплифицируют связавшиеся с мишенью олигонуклеотиды, получая обогащенную библиотеку.

Рис. 2. Общая схема получения аптамеров. Каждый раунд отбора состоит из 1. дизайн комбинаторной оцДНК- или РНК-библиотеки; 2. химический синтез комбинаторной стадий: оцДНК- или РНК-библиотеки; 3. инкубирование комбинаторной библиотеки олигонуклеотидов с молекулой-мишенью; 4. отделение комплексов комбинаторной библиотеки с мишенью от несвязавшихся молекул; 5. разрушение комплексов комбинаторной библиотеки с мишенью и амплификация связавшихся с мишенью олигорибонуклеотидов; 6. клонирование и секвенирование обогащенной библиотеки после последнего раунда отбора, определение нуклеотидных последовательностей индивидуальных аптамеров.

Комбинаторная библиотека проходит несколько раундов отбора до тех пор, пока сродство обогащенной библиотеки к молекуле-мишени не достигнет максимума. Обычно для этого требуется 4 - 20 раундов SELEX, что занимает от нескольких недель до нескольких месяцев. Применение автоматических методов отбора аптамеров существенно ускоряет этот процесс и позволяет проводить до 10 раундов отбора в день [31].

Обогащенную дцДНК-библиотеку, полученную в последнем раунде SELEX, клонируют и секвенируют. Последовательности индивидуальных клонов анализируют и определяют оптимальную аптамерную последовательность (п. 1.4.).

С тех пор, как впервые был предложен метод SELEX для отбора аптамеров [4, 5], создано и апробировано более десятка его различных модификаций. В табл. 1 приведены виды SELEX, использующиеся при отборе аптамеров к белковым молекулам-мишеням.

Таблица 1. Виды отбора НК-аптамеров к белковым мишеням.