Гистологические исследования

Гистологические исследования включали приготовление и микроскопирование гистологических препаратов идентичных участков костных регенератов в зонах огнестрельных переломов большеберцовых костей баранов. Забор тканей для гистологического исследования осуществляли после выведения животных из эксперимента на 14, 30, 60 сутки от начала опыта. Голени задних конечностей вычленяли из суставов, от кости отделяли мягкие ткани и затем выпиливали фрагмент диафиза, включающий регенерат с прилежащими отделами костных отломков и фиксировали в 12% растворе нейтрального формалина в течение 10 суток. С целью декальцинации фрагменты костной ткани помещали в 5 % раствор трихлоруксусной кислоты на 30-40 суток. Дегидратацию материала проводили с помощью этилового спирта в постепенно возрастающих концентрациях. Далее из фрагментов диафиза вырезали стандартные блоки кости, которые заливали в целлоидин по стандартной методике. Срезы толщиной 10-20 мкм окрашивали гематоксилин-эозином по обычной схеме. Микроскопирование и фоторегистрацию осуществляли с помощью светооптического микроскопа «Leica DMLA» c цифровой фотокамерой «Leica DC-500».

Электронно-микроскопические исследования.

Морфогенез огнестрельных ранений, помимо общепринятых гистологических методов исследования, был также изучен методами сканирующей зондовой электронной и атомно-силовой микроскопии. Выбор данных методов электронной микроскопии обусловлен следующими обстоятельствами:

. Высокая разрешающая способность: сканирующих микроскопов в пределах 10-15 нанометров, атомно-силовых - до 2 нм.

. Минимальная пробоподготовка дает возможность изучения состояния структур костного матрикса в условиях близких к физиологическим (режим «естественной среды»).

. Возможность определения локального химического состава методом энергодисперсионного анализа в сканирующих зондовых микроскопах и проведения локальных микромеханических испытаний методом адгезиометрии в атомно-силовой микроскопии.

. Возможность получить информацию о тонкой структурно-функциональной организации поверхности тканевых структур и оценить практически не изученную роль поверхностных эффектов в морфогенезе раневых повреждений.

. Возможность исследовать структуру образца в режиме локальных тонких срезов. Это важно при изучении структуры, пространственной ориентации и смещений нанокристаллов гидроксиапатита в интерфейсе коллаген-вода-апатит (Миронов В.Л., 2005).

Сканирующая зондовая электронная микроскопия

Сканирующая зондовая электронная микроскопия выполнена на аппарате Philips SEM-515.

Использование данной методики дало возможность получить объёмные сканограммы тонкой структуры костного матрикса, выявить расположение ультратонких каналов и укладку нитей коллагена, покрытых кристаллами апатита как до, так и после воздействия ударной волны. Было выполнено определение локального химического состава методом энергодисперсионного анализа, для определения концентрации определённых химических веществ в раневом канале и на отдалении от него.

Атомно-силовая микроскопия

Исследования с применением атомно-силовой микроскопии выполнены с помощью зондовой нанолаборатории INTEGRA.

Данный метод исследования, благодаря своей крайне высокой разрешающей способности и чувствительности, позволил выявить пространственное взаиморасположение волокон коллагена и кристаллов гидроксиапатита, их форму, а также с его помощью были выполнены локальные микромеханические испытания (адгезиометрия), как в интактной кости, так и в зоне огнестрельного перелома.

Рентген-структурный анализ

Количественный анализ фазового состава минерального компонента кости проведен методом рентгеноструктурного анализа на дифрактометре «Shimadzu XRD-6000» с использованием фокусирующего пирографитового монохроматора на вторичном (рассеянном) пучке.

Обработка полученных рентгенограмм от поликристаллических образцов проводилась с использованием базы дифракционных данных ICDD и программы полнопрофильного анализа HOWDER CELL 2.4.